體外染色體畸變?cè)囼?yàn)原理、試驗(yàn)設(shè)計(jì)及常見(jiàn)問(wèn)題解答

第一題    染色體畸變實(shí)驗(yàn)過(guò)程中閱片需要配套什么顯微鏡，如何操作？

答：染色體畸變?cè)囼?yàn)使用的是正置顯微鏡，最好在100×油鏡下進(jìn)行觀察。先于低倍鏡下尋找背景清晰、分散良好、染色體收縮適中的中期分裂相細(xì)胞，再于油鏡下進(jìn)行染色體畸變觀察并記錄。

第二題    如何確定秋水仙素的濃度和處理時(shí)間？

答：若秋水仙素劑量大，則作用時(shí)間短；秋水仙素劑量小，則適當(dāng)延長(zhǎng)作用時(shí)間。本公司使用的秋水仙素濃度是1μg/mL，4h

第三題    如何根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)中藥物對(duì)細(xì)胞的毒性選擇后續(xù)給藥劑量，后續(xù)給藥設(shè)置幾個(gè)濃度梯度？

答：具體難度設(shè)置需要參考所屬受試物類型的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)細(xì)胞有毒性反應(yīng)時(shí)，最高濃度所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性應(yīng)達(dá)到約50%，最-低濃度應(yīng)無(wú)細(xì)胞毒性。后續(xù)試驗(yàn)應(yīng)設(shè)至少3個(gè)劑量組，組距在2~√10。

第四題    低滲目的是什么？有什么注意事項(xiàng)？

答：在低滲環(huán)境中，細(xì)胞易吸水膨脹，染色體鋪展，以便能在一個(gè)平面上觀察所有染色體形態(tài)，為后續(xù)染色做準(zhǔn)備。在低滲過(guò)程中我們需要注意以下幾點(diǎn)：

（1）低滲時(shí)間。低滲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可引起細(xì)胞破裂，染色體丟失；低滲時(shí)間不足，細(xì)胞膨脹度不夠，染色體聚集，分散不好，不利于閱片。本公司低滲是使用0.075mol/L的氯-化鉀溶液37℃水浴30~40min。

（2） 細(xì)胞操作需輕柔。低滲后的細(xì)胞會(huì)脹大，通透性增強(qiáng)，細(xì)胞操作過(guò)程一定要輕柔，以防細(xì)胞破裂。

（3）離心條件需適合。低滲后細(xì)胞膨脹，離心力過(guò)高，細(xì)胞容易破裂，導(dǎo)致染色體丟失；離心力過(guò)低，細(xì)胞不能沉淀，收集不到細(xì)胞。

第五題    一張撥片可觀察到200個(gè)中期分裂項(xiàng)嗎？如果不夠，該怎么處理？

答：大多數(shù)情況下，一張玻片很難找到200個(gè)可用于分析的中期分裂相，建議同一個(gè)劑量組多制作一些玻片，本公司一個(gè)劑量組通常會(huì)制作至少4張玻片，以保證足夠中期分裂相細(xì)胞可供分析。

第六題    低滲的溫度控制在什么范圍內(nèi)？

答：低滲時(shí)可保持溫度在37℃左右，此溫度下對(duì)細(xì)胞的影響較小。

第七題    在預(yù)實(shí)驗(yàn)中需要使用 s9做有活化系統(tǒng)的預(yù)實(shí)驗(yàn)嗎？

答：建議在預(yù)實(shí)驗(yàn)中加入S9活化系統(tǒng)進(jìn)行同步檢測(cè)，判斷有或無(wú)代謝活化系統(tǒng)條件下受試物對(duì)細(xì)胞的毒性作用。

第八題    封片怎么操作？

答：長(zhǎng)期保存玻片可使用中性樹(shù)脂膠對(duì)染色干燥后的玻片進(jìn)行封裝，操作時(shí)可在玻片邊緣滴加1-2滴中性樹(shù)脂膠，再將蓋玻片沿滴加位置順壓至整個(gè)玻片，過(guò)程中保持輕柔，避免殘留氣泡或過(guò)多溢膠，以免影響后續(xù)觀察。

第九題    CHL細(xì)胞鑒定包括哪些方面？合格判定的標(biāo)準(zhǔn)是什么？

答：

（1）功能特性驗(yàn)證?：細(xì)胞貼壁成纖維樣，倍增時(shí)間＜24小時(shí)；

（2）純凈度檢測(cè)?：支原體檢測(cè)，結(jié)果需陰性；

（3）染色體核型鑒定?：檢測(cè)染色體數(shù)目與結(jié)構(gòu)。CHL細(xì)胞需保持核型穩(wěn)定，正常染色體數(shù)為25±2條，13條等臂染色體、12條端著絲粒染色體，自發(fā)畸變率＜5%。

第十題    細(xì)胞毒性預(yù)實(shí)驗(yàn)有哪些注意事項(xiàng)，MTT結(jié)果可以代替嗎？

答：細(xì)胞毒性預(yù)實(shí)驗(yàn)需注意同步帶上溶劑對(duì)照，并建議在染毒結(jié)束后進(jìn)行鏡下記錄觀察，再采用一定方法進(jìn)行量化。MTT法和CCK-8法都是比較常用的細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑，都可用與該實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞毒性判斷。

十一題    加活化系統(tǒng)和不加活化系統(tǒng)在畸變結(jié)果上有差別嗎？差別大嗎？

答：添加代謝活化系統(tǒng)（?+S9?）與不添加（?-S9?）可能導(dǎo)致畸變結(jié)果的顯著差異，具體取決于受試物的代謝特性。+S9系統(tǒng)是模擬哺乳動(dòng)物肝臟代謝環(huán)境，可將前體化合物轉(zhuǎn)化為活性致畸代謝物。?-S9系統(tǒng)則是直接檢測(cè)受試物本身或其穩(wěn)定代謝物的遺傳毒性。

十二題    為什么選擇CHL作為常用細(xì)胞而不選擇CHO，有哪些區(qū)別？

答：CHL和CHO細(xì)胞都是大部分指導(dǎo)原則內(nèi)推薦使用的細(xì)胞系，而相較CHO細(xì)胞，CHL細(xì)胞的染色體數(shù)目相對(duì)穩(wěn)定，且目前大多機(jī)構(gòu)使用CHL細(xì)胞較多。

十三題    閱片時(shí)看不見(jiàn)著絲點(diǎn)染色體，都成單條染色體成對(duì)出現(xiàn)，這是為什么哪個(gè)步驟出現(xiàn)了問(wèn)題？

答：出現(xiàn)此結(jié)果的主要原因是未將細(xì)胞終止在有絲分裂中期，而是到了有絲分裂后期。可能是秋水仙素的作用時(shí)機(jī)稍晚或作用濃度過(guò)低所致，有絲分裂后期表現(xiàn)為著絲粒分裂，姐妹染色單體分離成獨(dú)立染色體，呈現(xiàn)“單條成對(duì)"向兩極移動(dòng)。

十四題    CHL細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)細(xì)胞準(zhǔn)備時(shí)推薦的接種密度多大，接種后培養(yǎng)多久時(shí)間可以開(kāi)始進(jìn)行染毒？

答：本公司使用T25瓶進(jìn)行試驗(yàn)，接種密度為6~9×10^4/mL，接種量為5mL，即每瓶細(xì)胞量是3×10^5個(gè)~4.5×10^5個(gè)。一般情況下，接種后24h左右細(xì)胞的融合率可達(dá)到80%即可進(jìn)行染毒，如果融合率不夠，也可以繼續(xù)培養(yǎng)直至滿足試驗(yàn)需求。

十五題    制片過(guò)程中離心后有黑色渣渣出現(xiàn)，最后滴出來(lái)的片沒(méi)有染色體，但是有很多細(xì)胞圈，是什么原因？

答：有黑色渣渣出現(xiàn)可能原因包括

（1）細(xì)胞碎片過(guò)度堆積?：組織消化不徹-底或低滲處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（>30分鐘），導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂釋放大量碎片，離心后形成黑色絮狀物。

（2）?固定劑殘留或變質(zhì)?：甲醇-冰醋酸固定液比例錯(cuò)誤（標(biāo)準(zhǔn)3:1）或陳舊固定液產(chǎn)生沉淀物，與細(xì)胞碎片結(jié)合呈黑色顆粒。

滴出來(lái)的片沒(méi)有染色體，但是有很多細(xì)胞圈的主要原因是細(xì)胞未被終止在有絲分裂中期，可能已完成細(xì)胞有絲分裂。

十六題    玻片想要長(zhǎng)期保存，需要如何處理？

答：要長(zhǎng)期保存玻片，需正確使用中性樹(shù)脂膠對(duì)玻片進(jìn)行封裝，后續(xù)密封放置于陰涼處，可保存數(shù)年。

十七題    受試物容易析出結(jié)晶，難以溶解，最大溶解度的細(xì)胞毒性達(dá)不到50%。這種情況如何設(shè)置濃度？

答：在染色體畸變?cè)囼?yàn)中，受試物溶解性差且最大溶解度下細(xì)胞毒性不足50%時(shí)，需結(jié)合對(duì)應(yīng)指導(dǎo)原則采取措施。當(dāng)觀察到肉眼可見(jiàn)的沉淀時(shí)，可放棄50%細(xì)胞毒性的硬性要求。同時(shí)試驗(yàn)允許使用1個(gè)含可見(jiàn)沉淀的濃度?，但需確保沉淀不覆蓋細(xì)胞層或干擾顯微鏡觀察；沉淀在培養(yǎng)液中分布均勻，避免局部高濃度損傷。?

十八題    請(qǐng)描述一下畸變類型粉碎性的染色體。

答：“粉碎性的染色體"可能由于低滲時(shí)間過(guò)久、滴片位置較高、重懸操作用力過(guò)度所致，細(xì)胞膜破裂，導(dǎo)致內(nèi)部染色體被釋放至外部分散存在。