ASGPR：GaINAc-siRNA藥物實現(xiàn)肝內(nèi)靶向遞送的關(guān)鍵靶點

關(guān)鍵詞：去唾液酸糖蛋白受體 (asialoglycoprotein receptor，ASGPR)，N-乙酰半乳糖胺(GalNAc), GaINAc-siRNA,食蟹猴肝細胞，siRNA遞送，肝細胞轉(zhuǎn)染，肝細胞自由攝取，肝細胞遞送，原代肝細胞，猴肝細胞，人肝細胞，Cynomolgus Monkey Hepatocytes(PCH), Human Primary Hepatocytes(PHH), Primary hepatocyte siRNA transfection，siRNA Galnac hepatocyte delivery，Hepatic Targeted Delivery

siRNA等小核酸藥物通常需要借助遞送系統(tǒng)以提高其遞送效率和組織靶向性。GalNAc（N-乙酰半乳糖胺）偶聯(lián)修飾是當前最-常用的siRNA遞送系統(tǒng)，目前上市的siRNA藥物絕大多數(shù)采用GalNAc修飾來完成細胞內(nèi)siRNA遞送。GalNAc是去唾液酸糖蛋白受體（Asialoglycoprotein receptor，ASGPR）的配體，ASGPR在肝細胞的膜表面高度特異性表達，GaINAc-siRNA (siRNA Galnac hepatocyte delivery)偶聯(lián)物通過特異性結(jié)合去唾液酸糖蛋白受體，在細胞內(nèi)吞作用下，將siRNA從細胞表面轉(zhuǎn)運至細胞中，從而實現(xiàn)肝細胞靶向遞送(Primary hepatocyte siRNA transfection)。由此可見，肝細胞膜表面ASGPR的表達情況是影響GaINAc-siRNA (siRNA Galnac hepatocyte delivery)等小核酸藥物進入細胞內(nèi)發(fā)揮藥效的重要因素之一。因此，在小核酸藥物研發(fā)初期，對肝細胞膜表面ASGPR的表達情況進行檢測是十分必要的，這對于體外評估小核酸藥物肝細胞自由攝取、肝細胞轉(zhuǎn)染等情況具有重要意義。

一、ASGPR簡介

 去唾液酸糖蛋白受體 (asialoglycoprotein receptor，ASGPR)，又名肝凝集素(liver lectin)，最初由美國的兩位科學(xué)家Gilbert Ashwell和Anatol Morell于1965年發(fā)現(xiàn)，因此也被稱作“Ashwell-Morell 受體"。哺乳動物的ASGPR由分子量約為48 kDa的大亞基 H1和分子量約為40 kDa的小亞基H2 這兩個不同基因編碼的亞基組成，這兩個亞基是彼此高度同源的糖蛋白，兩個亞基都屬于Ⅱ型跨膜蛋白，且在哺乳動物中兩者含量的比例約為3:1，二者聯(lián)合具有內(nèi)吞作用。ASGPR的大小兩個亞基又分別有不同的剪接異構(gòu)體，如圖1所示。

圖1 H1和H2亞基不同的剪切異構(gòu)體 （a）H2的剪切異構(gòu)體 （b）H1的剪切異構(gòu)體（來源：人體去唾液酸糖蛋白受體的檢測）

ASGPR以極性方式表達于肝實質(zhì)細胞正弦和基底外側(cè)的細胞膜表面，除了肝細胞表面，ASGPR還會表達在一些肝外組織中，例如腹膜巨噬細胞，大鼠及人類睪丸，人類精子，人腸上皮細胞和甲狀腺細胞。然而，ASGPR在肝細胞上的表達遠遠超過了身體其他部位所表達的ASGPR，一個肝細胞中平均高表達500,000個ASGPR。ASGPR能專一識別和結(jié)合末端帶有半乳糖(Gal)殘基或乙酰半乳糖胺(GalNAc)殘基的寡糖或寡糖蛋白,目前已見報導(dǎo)的ASGPR配體包括去唾液糖蛋白、乳糖酸(lactoBioni cacid, LA)、半乳糖化配體(galactosylated ligand,Gal)、無唾液酸胎球蛋白(AF)以及豆甾醇糖苷(soyBean-derived sterylglucoside,SG)等。其中，N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）是與ASGPR結(jié)合能力最-強的一種乳糖類似物。因此，可利用ASGPR的內(nèi)吞機制及配體特性以實現(xiàn)藥物的肝內(nèi)靶向遞送(Hepatic Targeted Delivery)。

二、ASGPR：GalNAc-siRNA偶聯(lián)藥物實現(xiàn)肝靶向遞送(Hepatic Targeted Delivery)的關(guān)鍵靶點

  siRNA藥物具有基因沉默效率高、高度特異性、靶點范圍廣、不良反應(yīng)可控、可實現(xiàn)長效作用、合成方便等優(yōu)點，是當前極-具前途的小核酸藥物。然而，siRNA藥物通常不具備特定器官和組織的靶向性，難以單獨成藥。此外，siRNA的分子量較大，且?guī)в胸撾姾?，使其不能自由通過生物膜。因此，siRNA藥物通常需要借助遞送系統(tǒng)以提高遞送效率和組織靶向性。

GalNAc（N-乙酰半乳糖胺）是當前最-常用的siRNA藥物遞送系統(tǒng)，目前上市的siRNA藥物絕大多數(shù)采用GalNAc修飾來完成細胞內(nèi)遞送（表1）。正如上文中提到的，GalNAc是去唾液酸糖蛋白受體（ASGPR）的高親和力靶向配體，其與ASGPR的結(jié)合具有高度特異性，ASGPR是一種內(nèi)吞性受體，在肝細胞膜表面高度特異性表達。通過ASGPR和網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，GalNAc能夠有效地將siRNA藥物從肝細胞表面轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)內(nèi)部。隨后，GalNAc-siRNA 偶聯(lián)物與ASGPR分離，ASGPR回到細胞表面而GalNAc-siRNA偶聯(lián)物進一步解離，釋放出的游離siRNA在細胞質(zhì)中沉默基因進而發(fā)揮藥效。GalNAc-siRNA偶聯(lián)物與ASGPR結(jié)合及細胞內(nèi)遞送過程如圖2所示。

表1 上市siRNA藥物一覽

圖2 GalNAc-siRNA偶聯(lián)物與ASGPR結(jié)合及細胞內(nèi)遞送過程（來源：GalNAc-siRNA Conjugates: Leading the Way for Delivery of RNAi Therapeutics）

由此可見，ASGPR是GalNAc-siRNA偶聯(lián)藥物實現(xiàn)肝內(nèi)靶向遞送的關(guān)鍵靶點，其在肝細胞膜表面的表達情況是影響siRNA等小核酸藥物進入細胞內(nèi)發(fā)揮藥效的重要因素之一。因此，在siRNA等小核酸藥物研發(fā)初期，對肝細胞膜表面ASGPR的表達情況進行檢測對于體外評估siRNA等藥物肝細胞自由攝取和肝細胞轉(zhuǎn)染等情況具有重要意義。

三、IPHASE 貼壁食蟹猴肝細胞Cynomolgus Monkey Hepatocytes(PCH)ASGPR靶點檢測

 鑒于此，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，不斷開拓創(chuàng)新，緊跟市場發(fā)展步伐，及時響應(yīng)客戶需求，對生產(chǎn)的貼壁食蟹猴肝細胞Cynomolgus Monkey Hepatocytes(PCH) ASGPR靶點表達情況進行檢測，旨在為廣大客戶提供優(yōu)質(zhì)的siRNA藥物體外研究模型。IPHASE技術(shù)人員以0.5 million cells/ml的細胞密度鋪板于96孔板中，待細胞貼壁4h后檢測ASGPR表達情況，結(jié)果顯示IPHASE研發(fā)的食蟹猴肝細胞高表達ASGPR，說明IPHASE生產(chǎn)的食蟹猴原代肝細胞（Primary Hepatocytes）較好的保留了肝細胞表面膜上蛋白的表達，可滿足客戶的試驗需求。

此外，IPHASE為滿足不同客戶的研究方向，以豐富的研發(fā)經(jīng)驗和技術(shù)體系，生產(chǎn)了多種屬、多品系的原代肝細胞（Primary Hepatocytes）及相關(guān)輔助產(chǎn)品，如下表所示為部分產(chǎn)品，以助力廣大客戶的藥物研發(fā)需求。

參考資料：

[1] Springer AD, Dowdy SF. GalNAc-siRNA Conjugates: Leading the Way for Delivery of RNAi Therapeutics. Nucleic Acid Ther. 2018;28(3):109-118.

[2] 施奇敏. 人體去唾液酸糖蛋白受體的檢測[D]. 江南大學(xué). 2019.

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