酶抑制IC50試驗研究原理和試驗方法

1    酶抑制研究的重要性

藥物代謝的主要場所是肝臟，其中細胞色素 P450（CYP）酶為主要的代謝酶，其亞型 CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、 CYP3A4參與了體內80%以上的藥物代謝。CYP酶是一個多功能的酶系，在體內具有可誘導性和可抑制性。該酶與藥物的相互作用能夠在所有的體內過程（包括吸收、分布、代謝和排泄）中發生，其中以代謝過程尤為突出，約占40%。

近年發現，藥物相互作用是臨床上產生嚴重不良反應甚至死亡的主要原因之一。CYP參與的藥物相互作用主要包括兩種類型：酶抑制（enzyme inhibition）和酶誘導（enzyme induction）。酶抑制是指某些化合物能抑制肝臟藥物代謝酶的活性，導致聯合用藥時一些藥物代謝減慢，使得藥物的血藥濃度上升致毒性；酶誘導是指某些化合物能提高肝臟藥物代謝酶的活性，導致合同的藥物代謝速率加快，使得原藥的血藥濃度下降，使其療效降低或喪失。

圖1 藥物相互作用模式示意圖

為獲得更好的治療效果，聯合用藥在臨床治療中已非常普遍。然而，在獲得更好的療效的同時，常伴隨著由藥物-藥物相互作用（drug-drug interaction，DDI）引起的不良反應事件的發生。如特非那丁與酮康唑合用時，酮康唑可顯著地抑制特非那丁的代謝，造成特非那丁的血藥濃度顯著升高，可以導致致命的室間心律失常。

圖2為采用肝微粒體技術研究西尼地平與幾種臨床常用藥物間的代謝相互作用的實例，結果表明環孢素、紅霉素和辛伐他丁在體外表現出對西尼地平代謝的抑制作用，由于三者均是CYP3A的抑制劑或底物，這提示西尼地平與CYP3A的抑制劑或底物合用時可能會出現代謝上的相互作用，使西尼地平的代謝速率降低，西尼地平二氫吡啶環脫氫代謝物生成減少，而原型藥物的水平顯著提高，這可能會影響臨床療效的正常發揮。

圖2 人肝微粒體中幾種臨床常用藥物對西尼地平代謝的影響

如果合用的藥物具有潛在的抑制或誘導代謝酶的能力，則前者將受到合用藥物的影響，從而使其代謝清除途徑發生量化的改變，這種藥物相互作用可能會影響治療效果，增加藥物的治療失敗率，甚至誘發不良反應。因此，通過對代謝酶表型的體外研究來判定該化合物的主要代謝酶亞型，已成為藥物臨床前代謝研究工作中的一部分。

2    酶抑制IC50研究試劑盒簡介

參與藥物代謝的CYP450酶主要為CYP1、CYP2和CYP3三個家族，共有7種重要的亞型，分別為CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4。通過考察不同濃度的藥物對各種酶亞型的特異性底物的代謝速率的影響，得到半數抑制濃度（IC50），便可評價藥物對酶的抑制作用。

公司針對酶抑制IC50研究的需要，以肝微粒體體外溫孵法為指導，開發了一款專門用于酶抑制IC50研究的試劑盒，該產品可直接用于藥物對CYP450活性抑制的的研究，省去了肝微粒體制備和試劑配制的繁瑣過程，大大縮短了實驗周期，且試劑盒各組成成分經過嚴格的質量檢測，符合酶抑制IC50研究試驗要求，實驗結果準確、可靠、重現性好。

2.1 產品說明

本產品提供了藥物酶抑制（IC50）研究的主要試劑，可直接用于藥物對CYP450酶的半數抑制濃度（IC50）研究，省去了試劑配制的繁瑣過程，且試劑盒各組成成分經過嚴格的質量檢測，實驗結果準確、可靠、重現性好。

根據微粒體種屬的不同，可根據實際需求選擇人肝微粒體、恒河猴肝微粒體、比格犬肝微粒體、大鼠肝微粒體和小鼠肝微粒體中的一種。

2.2 試劑盒優勢

便捷——本試劑盒省去了肝微粒體制備和試劑配制時間，可以直接使用，大大縮短了實驗周期。

準確——本試劑盒各成分均經過嚴格的質量檢測，實驗結果準確、可靠、重現性高。

穩定——本試劑盒穩定性強、易于運輸和保存。

2.3 試劑盒組成

2.4 參考使用方法

2.4.1 試驗組

1）冰浴融化試劑盒各組分，置于冰上待用；

2）除微粒體外，將孵育體系其它各組分按照配比混合并吹吸混勻，于37℃預孵育5min；

3）將以上混合液195μL/管分裝至2.0mL離心管中，于37℃水浴中保溫， 5μL/反應加入肝微粒體，吹吸3次混勻于37℃水浴條件下啟動代謝反應，使用秒表計時；

4）于設定孵育時間點，向孵育體系中加入終止液終止反應（如預冷乙腈，預冷乙腈體積：孵育體系體積=1:1）。

例：200μL孵育體系配制：

注：

a.體系中有機溶劑加入量不得大于1%；

b.若實際需要n個孵育體系，則需配置n＋1個體系；

c.本實驗需設置系列受試物濃度，通常為0μmol/L、0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L；

d.參考使用方法僅為使用范例，需根據實際試驗需求進行調整。

2.4.2對照組：

無A、B液組：反應體系中不加A液和B液，其它組分加入量不變，缺少體積用0.1M PBS緩沖液補齊。

2.4.3結果計算：

用各特異性探針底物的代謝物的生成速率反映微粒體孵育體系中各CYP450亞型酶的活性；設定只含代謝底物的孵育體系中各亞型酶活性為*，作為對照；樣品中代謝物生成速率相對于對照組生成速率的百分比，作為各亞型酶的剩余活性。

活性剩余百分比 = (某濃度樣品底物代謝物生成速率/零濃度樣品代謝物生成速率) × 100%

2.4.4使用注意事項：

1）試驗開始前，請自行準備2.0mL離心管、不同規格槍頭、37℃水浴鍋等；

2）本產品僅供科研使用，不能用于人體及動物的治療或臨床診斷；

3）使用前，需于冰浴條件下解凍并混合均勻；

4）于-70℃冰箱冷凍保存，切勿反復凍融；

5）在使用過程中，也可根據實際實驗需求調整試劑盒使用方法和各組分的加入量；

6）因CYP2B6和CYP2C19在體外沒有絕對特異的抑制劑可用，故結果分析還需結合其它結果進行，如重組酶法的結果。

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