骨髓單個核細胞分離方法及注意事項

骨髓單個核細胞（Bone Marrow Mononuclear Cells，BMMNCs）是一群混合細胞，其中絕大多數是早幼粒細胞、早幼紅細胞、成熟B細胞、T細胞和單核細胞等，還含有少量的干細胞，包括間充質干細胞、造血干細胞和內皮祖細胞等，它們密度相近，因此可通過密度梯度離心法從骨髓液中分離出來。

單個核細胞的體積、形態和比重與其它細胞不同，在沉降過程中不同比重的細胞會處于不同的分布位置。因此，可利用各種血細胞和單個核細胞比重之間的差異將各種血細胞與單個核細胞分離開來。

1）  無菌條件下抽取骨髓于含抗凝劑的采血管內，將骨髓與生理鹽水或PBS溶液按等比例混勻，備用。

2）  按照稀釋骨髓：細胞分離液比例為3:2的比例，緩慢將稀釋骨髓液加入到細胞分離液上層，需保持液面分界清晰。

3）  800g，室溫，離心 20min-30min（注：設置較慢的加速度和減速度，如果有十檔，設為第三檔）。

4）  小心吸取骨髓單個核細胞層（即白膜層）并轉移至15mL離心管中。離心結束后，管內液面從上至下依次為無細胞骨髓液層、骨髓單個核細胞層、分離液層和紅細胞層（見圖1）。

5）  向離心管中加入10mL 的生理鹽水或PBS重懸細胞，250g，室溫離心 10min ，棄上清。重復該步驟 1~2 次，即可用于后續試驗。

1）  不同種屬動物單個核細胞的比重有一定差異，請選擇合適的分離液進行骨髓單個核細胞的分離。

2）  骨髓液新鮮程度是影響分離效果的關鍵因素，請盡量使用采集后24小時內的骨髓液進行單個核細胞分離。

3）  為保證細胞的活力，整個操作過程請輕柔，避免對細胞造成機械性的損傷。

4）  為保持細胞狀態良好，請盡量縮短整個試驗的周期。

IPHASE/匯智和源針對不同種屬動物骨髓單個核細胞分離的特點，開發了對應的單個核細胞分離試劑盒，包括人，猴，犬，大鼠，小鼠，兔，豬等。該試劑盒包含單個核細胞分離液和洗滌液兩個組分，各成分對細胞無毒性，不會影響細胞的原始狀態；同時，該試劑盒操作簡單便捷，可大大縮短細胞分離時間，分離所得細胞純度高、狀態好、得率高。